病理實驗技術

 

1、 什么是病理學實驗技術？ 

 

病理學技術（組織標本切片和染色技術）是組織學、病理學等學科用于觀察和研究組織與細胞的正常形態(tài)及病理變化的常用方法。 

 

2、 什么是組織制片技術及其目的？ 

 

組織經(jīng)過固定、切片和染色后，光波通過被檢組織成分時，波長和振幅發(fā)生改變，在顯微鏡下能清晰的觀察其組織結(jié)構(gòu)，稱之為光鏡標本的基本制作方法或稱為組織制片技術。 

 

目的生物學標本在生活狀態(tài)下多為無色透明，而且組織一旦離開機體后很快就會死亡，其結(jié)構(gòu)就會失去正常狀態(tài)。必須對組織采取固定、切片和染色措施！ 

 

3、 組織非切片制片方法有哪些？ 

 

(1)組織分離標本 

 

(2)組織活體標本 

 

(3)組織涂片標本

 

(4).磨片標本

 

(5)整體封存（壓片）標本

 

(6)組織鋪片標本

 

(7)組織印片標本等 

 

4、 根據(jù)所使用支持物質(zhì)的不同，組織切片方法分為哪些種類？組織切片的主要程序。  

 

根據(jù)所使用支持物質(zhì)的不同，切片方法分為：

 

(1)石蠟切片法

 

(2)火棉膠切片法

 

(3)冰凍切片法

 

(4)超薄切片法（電鏡技術）

 

(5)樹脂切片

 

(6)碳蠟切片 

 

組織切片的主要程序： 

 

取材、固定→脫水→透明、浸透→包埋、切片→貼片、染色→浸洗→脫水→透明→封固。 

 

5、 標本主要來源及取材的要求、取材主要注意事項？ 

 

來源：臨床活體檢查，手術切除，病理解剖，實驗動物等 

 

要求：

 

(1)根據(jù)實驗目的和要求及病變程度合理取得組織材料。

 

(2)取材的過程迅速、準確 

 

組織取材注意事項

 

材料保持新鮮、標本大小適宜、勿使組織塊受擠壓、盡量保持組織的原有形態(tài)、選好標本切面、保持材料的清潔、切除不需要部分、明確編號，登記 

 

6、 何謂固定，固定的目的及主要方法有哪些？影響固定的因素及注意事項。常用固定液有哪些。 

 

標本（組織）固定是指從人體內(nèi)或動物體內(nèi)取下的材料立即浸泡在化學試劑中，借助化學試劑的作用，將組織 細胞結(jié)構(gòu)保存起來，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)近似生活狀態(tài)的一種手段。 

 

固定的目的： 

 

1）防止標本的自溶與腐敗，以保持組織細胞的固有形態(tài)。 

 

2）使組織細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種物質(zhì)成份沉淀或凝固成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。 

 

3）可增強染色的作用。使組織中的各種物質(zhì)沉淀凝固而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。 

 

4）固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，增加組織硬度，便于制片。 

 

5）防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。另外，對某些具有傳染性的標本，能防止疾病的擴散。

 

固定的方法： 

 

物理方法 干燥：血涂片  高熱：細菌涂片  低溫驟冷 

 

化學方法  使用化學試劑配制成固定液固定 

 

影響固定的因素：

 

1 .組織固定必須新鮮：無論取人體或動物組織，都必須立即投入固定劑。

 

2.防止組織因固定劑的作用而發(fā)生變形：

 

3.標本大?。涸诒ＷC形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性的同時，厚度不超過5mm。

 

4.固定液的量：一般為組織塊體積的20-30倍（不得少于標本體積的5倍）。

 

5.固定時間：根據(jù)組織的種類、大小，固定劑種類、性質(zhì)、滲透力的強弱而定。

 

6.固定溫度：室溫（20-25℃）或低溫（如4℃），一般不應超過40-45 ℃。

 

7.選擇適當?shù)墓潭ㄒ?/p>

 

8.促使固定 

 

注意事項：免疫組化固定方法的原則是：在保持細胞形態(tài)完好和所測抗原的前提下，應選用濃度zui低的固定液和zui短的固定時間。為此，固定組織時應該： 

 

1）組織新鮮，盡早、盡快固定。

 

2）組織塊盡量小。

 

3）固定后充分水洗，減少固定液造成的人 工假象。 

 

4）針對抗原、染色法選擇zui佳的固定方法 。 

 

常用的固定劑： 

 

1）10%福爾馬林緩沖液（pH7.4）

 

2）4%多聚甲醛磷酸緩沖液（pH7.4）

 

 3）Bouin液 

 

4）Zamboni’s液 

 

 5）丙酮  

 

6）95%乙醇  

 

7）A-F液 

 

7．何謂脫水，脫水的目的、常用脫水劑及脫水注意事項。 

 

定義：利用某種化學試劑逐步將標本內(nèi)部吸收的水分置換出來，以使標本處于無水狀態(tài)，這一過程叫脫水。 目的和原則1有利于標本的下一步處理，即透明、浸透、包埋 2有利于切片的操作 3有利于標本的長久保存 

 

常用的脫水劑：1.單純脫水劑：如乙醇、丙酮和甲醇 2.脫水兼透明劑：如正丁醇、叔丁醇等 

 

注意事項：脫水時必須由低濃度脫水劑開始，逐步轉(zhuǎn)入高濃度脫水劑，經(jīng)過各級濃度的脫水劑使其所含的水分逐漸減少而代之以脫水劑。防止組織過度收縮變形，或脫水不完全而影響制片效果。 

 

8．石蠟包埋程序 

 

1）組織取材3mm厚度，固定于福爾馬林數(shù)小時后再換以新鮮福爾馬林固定數(shù)小時。

 

2）組織流水沖洗6-12h。 

 

3）70％酒精2-4h。

 

4）80％酒精2-4h。

 

5）90％酒精2-4h。

 

6）95％酒精（Ⅰ、Ⅱ）2-4h。

 

7）100％酒精（Ⅰ、Ⅱ ）1-2h。

 

8）二甲苯（Ⅰ）5-30min。

 

9）(二甲苯（Ⅱ） 5-30min)。

 

10）浸蠟（Ⅰ、Ⅱ ）2h。

 

11）組織包埋 

 

9、石蠟切片與冰凍切片的優(yōu)缺點？ 

 

石蠟切片優(yōu)點1.標本大小靈活2.切片厚度均勻（1-200μm）3.可少量或批量制作4.切片保持時間長 缺點1.不能很好地保存細胞組織內(nèi)酶或抗原的活性2.脂肪被溶解3.不能保障大且堅硬組織的切片質(zhì)量 

 

冰凍切片法優(yōu)點• 切片制作時間短• 較好的保存脂肪和類脂、酶及抗原活性• 可應用于脂肪顯示，酶的定位、定性甚至定量、組織熒光、免疫熒光和放射自顯影等方面 

 

缺點• 標本結(jié)構(gòu)和形態(tài)的顯示遜色于石蠟切片• 冷凍過程中易形成“冰晶”• 難以制作連續(xù)切片和薄的切片 

 

10、染色的目的，普通染色、特殊染色、復染色定義。常用染色方法。

 

染色的目的：將標本切片浸于染色劑內(nèi)，經(jīng)一定的時間，使組織或細胞及其他的成分被染上不同的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，便于在光鏡下進行觀察。 

 

普通染色：zui廣泛應用的是蘇木精和伊紅染色，又稱常規(guī)染色。 特殊染色：為顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或其他的特殊成分。 復染色：襯托主染色所進行的染色。

 

常用的染色方法 

 

一）蘇木精（素）：是現(xiàn)今zui常用、zui有價值的常規(guī)細胞核染色劑，習慣上稱蘇木精是堿性染料 

 

二）伊紅：是一種胞漿較理想的染色劑。常用伊紅Y。酸性染料組織成分呈彌漫性染色。 

 

11、石蠟切片常規(guī)染色步驟。 

 

1） 脫蠟至水 

①二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5-10min②100%乙醇 （5～10）min×2或3次③依次95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5～10min④蒸餾水浸洗 2～5min 

 

2）蘇木精染色： 

① 蘇木精1-10min。② 自來水流水沖洗。③ 0.5%鹽酸-乙醇分色，數(shù)秒-數(shù)十秒。自來水快洗。④ 0.5%氨水藍化，30sec-1min，自來水沖洗⑤ 光鏡下鏡檢細胞核分色程度。⑥ 自來水流水沖洗3min。 

 

3）伊紅染色 

① 1%伊紅1-10min。 ② 蒸餾水快洗。 

 

4）脫水、透明和封固： 

① 70%、80%、90%乙醇速洗，每級數(shù)秒-數(shù)十秒。② 95%30sec-1min.光鏡下監(jiān)控細胞核與細胞質(zhì)顏色對比。 ③ 100%乙醇，3-5min，2次。④ 二甲苯Ⅰ、Ⅱ,各5-10min。⑤ 封片:中性樹膠

 

12、組織化學定義及特征。 

 

組織化學（histochemistry)或細胞化學（cytochemistry）：是基于已知的化學反應，在組織或細胞原位上顯示出組織或細胞中的化學物質(zhì)，并研究其化學性質(zhì)及功能關系的一門技術。是在形態(tài)學的基礎上，研究組織或細胞中化學物質(zhì)的形態(tài)、化學成分及定位、定量和代謝狀態(tài)的學科。 

 

組織化學的特征：應用物理的和化學的方法來查明細胞或組織的化學成分； 用組織學、化學、物理學原理，研究細胞或組織的結(jié)構(gòu)、功能與化學的關系； 

 

對細胞或組織成分的定位、定性、定量的特征進行研究，來認識細胞或組織結(jié)構(gòu)與功能的關系。 具有較強的特異性。 

 

13、組織化學技術的基本要求。 

 

為了能在完好的結(jié)構(gòu)上同時顯示其化學物質(zhì)，組織化學技術必須做到：

 

（1）保存組織（細胞）在生活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)； 

 

（2）保存組織（細胞）內(nèi)的生前化學成分、酶活性及檢測目的物； 

 

（3）所使用的染色方法是按照已知的化學或物理反應原理進行。 

 

（4）反應產(chǎn)物應在組織結(jié)構(gòu)上形成穩(wěn)定的有色沉淀物質(zhì)。 

 

（5）檢測手段要有高度的敏感性、特異性和可重復性。 

 

（6）生成物的反應產(chǎn)物必須在原位沉淀，保證定位的精確性及穩(wěn)定性。 

 

14、組織（細胞）化學基本步驟冰凍切片或石蠟切片等常規(guī)處理后，再進行組織（細胞）化學染色，在光鏡下觀察。 

 

15、組織（細胞）化學染色方法分類。 

 

純化學方法：Schiff反應法、偶氮偶聯(lián)法、金屬沉淀法、聯(lián)苯胺反應、四唑鹽反應 

 

類化學方法：屬某些特殊染色技術，如：Best洋紅染色 顯示糖原，Baker酸性蘇木精染色 顯示磷脂，Mayer黏洋紅與黏蘇木素 顯示黏蛋白 

 

物理學方法：1）脂溶染色法2）熒光分析3）放射自顯影 物理化學方法等 

 

16、糖類、蛋白質(zhì)、核 酸及脂類物質(zhì)的常用顯示方法。 糖類物質(zhì)的顯示方法： 

 

PAS顯示法（Periodic Acid Schiff）、阿利新藍法（Alcian Blue）、阿利新藍-PAS復合法（Alcian Blue-PAS）、胭脂卡紅法（Carmine method）、甲苯胺藍法 硫堇法等。 

 

蛋白質(zhì)顯示方法：

 

1、pH4.2以下的酸性溶液中，用堅牢綠、溴酚藍、麗春紅-2R等酸性染料染色，出現(xiàn)陽性結(jié)果表明有蛋白質(zhì)存在

 

2、在pH8.0以上的堿性溶液中，用酸性染料染色，呈陽性結(jié)果表明含堿性蛋白質(zhì)

 

3、若第2步為陰性結(jié)果，則改在酸性溶液中用堿性染料（亞甲基藍）染色。 

 

核 酸顯示：1、顯示DNA ： Feulgen法試劑：Schiff試劑、鹽酸、亞硫酸氫鈉 2、核仁組成區(qū)和酸性粘多糖復合顯示法：試劑：2%的甲酸、2%的明膠、50%的硝 酸銀、阿申藍（8GX）、醋酸溶液3、粘多糖和核仁組成區(qū)雙染法試劑：Schiff氏試劑、膠性銀液 4、RNA和DNA的甲綠-派若寧顯示法試劑：甲綠、派若寧。 

 

17、酶組織（細胞）化學、常用方法及影響酶活性的因素。 

 

酶組織（細胞）化學：用組織（細胞）化學方法顯示酶在組織或細胞內(nèi)的定位的技術。 

 

常用的方法：酸性磷酸酶  堿性磷酸酶  三磷酸腺苷酶  乙酰膽堿酯酶  細胞色素氧化酶 一氧化氮合酶 

 

影響酶活性的因素：

 

1 、溫度：大部分酶反應的合適溫度為37℃。

 

2、 pH： 酶有適合酶反應速度的pH(大部分為7.0   

 

3、抑制劑 能使酶活性降低的物質(zhì)

 

4、激 活劑 能使酶活性增高的化學物質(zhì)

 

5 、底物濃度對酶反應速度的影響